Синтез пептидов из L-Ac-AA-CN + H2S (Cavanelli, 2019)

Синтез пептидов из L-Ac-AA-CN + H2S (Cavanelli, 2019)

Сообщение р.Б.Константин » 12 июл 2019, 14:17

Peptide ligation by chemoselective aminonitrile coupling in water
Pierre Canavelli, Saidul Islam & Matthew W. Powner
Nature https://www.nature.com/articles/s41586-019-1371-4

Доп. материалы (237 страниц, 27.2Мб)

Аминокислоты (англ. amino-acids, сокр. АА) имеют формулу NH2-R-COOH, где
aa.jpg
aa.jpg (7.42 KiB) Просмотров: 535

-NH2 - амино-группа,
-COOH - карбоксильная группа,
R - особенный для каждой аминокислоты "радикал". Для простейшей аминокислоты, глицина (Gly) - это -СH2-.
В белках аминокислоты соединяются своими амино- и карбоксильными остатками, образуя пептидные связи -CO-NH-:
NH2-R-CO-NH-R-CO-NH-...-NH-R-COOH
Все биоаминокислоты, кроме простого глицина, существуют в виде зеркально симметричных D- и L-стереоизомеров, у животных и растений белки состоят из L-аминокислот.

В водном растворе аминокислоты относительно инертны, образовать пептидную связь не могут (требуется затрата энергии). В организме синтез белков происходит на молекулярных фабриках, рибосомах, с активированными аминоацил-тРНК и с тратой энергии макроэргов - АТФ.

Еще Орджел в золотой век абиогенеза предполагал, что активироваться аминокислоты могут через взаимодействие с остатками синильной кислоты (-CN) и сероводородом (H2S).
Однако у него не получилось.
Авторы повторили попытки Орджела: нитрильное производное глицина (Gly-CN) за семь дней инкубации с H2S образует небольшое количество тиоамида: Gly-S-NH2.
тиоамид образует дипептид глицина, но с невысоким выходом - 14%.
Тогда авторы статьи придумали активировать глицин с обеих сторон:
со стороны -COOH будет -CSNH2 (тиоамид, связи С=S, C-NH2),
cо стороны H2N- будет СH3-CO-NH- (ацетил-NH-)
И тогда такая модифицированная c обеих сторон аминокислота при определённых (типа, "пребиотических" условиях, с гексацианоферратом калия или с хлоридом меди(II)), будет трехстадийно полимеризоваться.

Итак, вот механизм реакции, буквами А-F я обозначил "процедуры" из приложения к статье, которые описаны ниже.
cycle-proc.png
cycle-proc.png (65.56 KiB) Просмотров: 450


Условные обозначения
ВпКТ - встряхивать при комнатной температуре
ЛФ - лиофилизировать (высушить в вакууме)
ВЭЖК - извлечь нужное соединение на специальной колонке (высокоэффективная жидкостная хроматография)
ДГВ - дегазированная вода
pH->... - довести pH до нужной величины с помощью NaOH или HCl.
Ar - убрать газ (H2S) продуванием инертным газом аргоном

Красным цветом выделены реагенты или факты, которые отдаляют нас от "пребиотического синтеза пептидов".

Процедура 0. Синтез аминоацил-нитрилов
Реакция абиогенного синтеза соединений аминокислот с -CN (аминоацил-нитрилов) не приводится. Просто берутся фабрично синтезированные и очищенные аминонитрилы. Считается, что они должны были синтезироваться пребиотически и достигать концентраций 100-200 мМ (миллимолей на литр), по кр. мере локально.
На самом деле нитрилы аминокислот известны по "реакции Штреккера" (циангидринному синтезу):
Strecker.jpg
Strecker.jpg (33.15 KiB) Просмотров: 450

Из альдегидов в присутствии цианида аммония образуются циангидрины, а циангидрины... в кислой среде превращаются в аминонитрилы, которые быстро превращаются аминокислоты, а в щелочной (которая используется в данной работе) - циангидрины полимеризуются или гидролизуются (см. Между Харибдой Миллера и Сциллой Орджела..)
Вывод: Процедура 0 должна производиться в другое время или в другом месте (кислая среда), причем, среда затем должна быстро измениться с кислой на щелочную, иначе нужные нам аминонитрилы распадутся едва образовавшись

Ещё одна особенность синтеза AA-CN по Штреккеру в том, что получается рацемат, смесь стереоизомеров, D- + L-, а не биологическая L-форма.
А так, предшественниками АА-CN выступают альдегиды (соединения формата R-CHO, как на картинке выше):
формальдегид H-CHO -> (нитрил) -> глицин
ацетальдегид CH3-CHO -> (нитрил) -> D-/L-аланин,
бензальдегид C6H5-CHO -> (нитрил) -> D-/L-фенилаланин, т.е. для простых аминокислот предшественники - простые "пребиотические" альдегиды, а вот для остальных аминоацил-нитрилов соответствующие альдегиды будут уже экзотикой.

Процедура А. Синтез N-ацетил-аминоацил-нитрилов из аминоацил-нитрилов
AA-CN -> Ac-AA-CN (выход реакции ~93-99%)

AA-CN*HCl (50 мМ) + тиоацетат калия (150 мМ), pH->9, + K3[Fe(CN)6] (450 мМ, 150 г/л). ВпКТ 20 мин.
Тиоацетат калия - 11 г/л 42% от нас.р-ра. Постепенно гидролизуется в щелочной среде.
Синтез: ацетангидрид + сероводород; или ледяная уксусная кислота + P2S5
Процедура B. AA-CN -> Ac-AA-CN (~94-99%, 74% Pro)
AA-CN*HCl (200 мМ), pH->9, + 100%-ный жидкий ацетоангидрид добавлялся по каплям 10 мин. из расчета 57 мл/л, 0,6М, pH постоянно доводилась до 9 щёлочью; ЛФ, ВЭЖХ
Ацетоангидрид реагирует с водой, особенно бурно в кислой среде. "Нет такого соединения как "водный раствор ацетангидрида". При гидролизе высвобождается уксусная кислота, поэтому pH постоянно титруют до pH 9.0
Известные методы синтеза ацетоангидрида используют ацетат+сульфурил/фосфорил хлорид / фосген / винилацетат / кетен
(для процедур А и B представлены данные только для 8 аминокислот).
Процедура C. Тиолиз N-ацетил-аминоацил-нитрилов
Ac-AA-CN + H2S -> Ac-AA-SNH2 (94-99% Gly, Ala, Phe, Ser, Val; 77% Pro, 58% Met, 32% Leu)

Ac-AA-CN*HCl (50 мМ) + NaSH*H20 (500 мМ), ДГВ, pH->9, ВпКТ 24-96 ч., pH->5, Ar, ЛФ, ВЭЖХ
(для процедуры С представлены данные только для 9 аминокислот).

Процедура D. Гидролиз N-ацетил-аминоацил-тиоамидов
Ac-AA-SNH2 + H2S -> Ac-AA-SH + Ac-AA-OH = S1-AA (выход 8-85%, 8% у валина)

Ac-AA-SNH2 (50 мМ) + NaSH*H20 (500 мМ) + метилсульфонилметан (50 мМ), ДГВ, pH->9,
инкубировать при 60С 24-168 часов, pH->9 (см. таблицу)
Ac-AA-SH.png
Ac-AA-SH.png (36.19 KiB) Просмотров: 569

(для процедуры D представлены данные только для 9 аминокислот).

Процедура E. Пребиотическое объединение активированной формы глицина (Ac-Gly-SH) с альфа-аминокислотами (AA) или альфа-амино-амидами (AA-NH2)
Ac-Gly-SH + AA / AA-NH2 -> Ac-Gly-AA-OH/NH2 + Ac-Gly-OH (выход 70-99%, 23% у тирозина)

AA / AA-NH2 (150 мМ) + Ac-Gly-SH (33 мМ), ДГВ, pH->9,5, ВпКТ 20 мин., pH->9,5, ЛФ,
К чести авторов, они более-менее описывают, что происходит вне оптимума синтеза. Например, вот таблица, по которой видно, что даже в синтезе простейшего ди-глицина (Gly-Gly) исходные активированные реагенты (Ac-Gly-SH и Gly-CN) должны быть в определённом соотношении, с определенной рН среды:
Gly-Gly.png
Gly-Gly.png (32.04 KiB) Просмотров: 569
При синтезе дипептида глицина с лизином образовывались также дипептиды с нестандартным связями (с аминогруппой радикала)

Процедура F. Пребиотическое объединение Ac-AA-SH (альфа-аминоацетил тиокислот) с аминоацил-нитрилами
Ac-AA-SH + AA-CN -> Ac-AA-AA-CN

AA / AA-NH2 (150 мМ) + Ac-Gly-SH (33 мМ), ДГВ, pH->9, + K3[Fe(CN)6] (100 мМ) ВпКТ 20 мин., pH->9, ЛФ,
Выход 70-99%, с проблемами у цистеина (образует -S-S- связи) и тирозина (%% выхода для него не приводится, для пары Gly-Tyr дается только выход 23% по процедуре Е)
Проблемы есть и у лизина: Ac-Lys-SH (30 мМ) в присутствии K3[Fe(CN)6] (90 мМ) при pH 9 и комнатной температуре за 20 минут практически полностью (92%) замыкается в лактамный цикл:
lactame.png
lactame.png (6.29 KiB) Просмотров: 538

Итак, на этапе синтеза активированных аминокислот (Ac-AA-SH) проблемы наблюдаются у следующих аминокислот:
валин, лейцин, лизин, цистеин, тирозин, в меньшей степени - пролин.

Не понятно, почему для расчёта выхода берутся довольно высокие концентрации реагентов, потому что авторы приводят таблицу с варьированием условий, по которой видно, что реакция идёт и в разы более низких концентрациях (но гораздо дольше, снижение концентрации реагентов в 10 раз требует в ~30 раз большего времени для достижения того же выхода реакции):
conditions.png
conditions.png (39.24 KiB) Просмотров: 558


Эта процедура проводилась также с заменой Gly на другие аминокислоты.
В целом, синтезировались дипептиды с глицином в любой комбинации, с аланином - почти в любой комбинации, а также
Ac-Phe-Phe-CN
Ac-Phe-Val-CN
Ac-Val-Val-CN

Какой выход реакции для 80% остальных пар дипептидов - не указывается. Видимо - никакой.

С помощью повтора циклов процедур C-D-E, C-D-E, итд. можно синтезировать полиглицин вплоть до пента-глицина (с уменьшающимся выходом вплоть до 13% для Ac-(Gly)5-CN)
Ac-(Gly)5-CN.png
Ac-(Gly)5-CN.png (29.63 KiB) Просмотров: 569


Трипептиды, пента и гекса-пептиды можно объединять друг с другом по процедуре F (с гексацианоферратом калия) (3+3, 5+3, 6+3, 6+5)
Образуются олигопептиды типа Ac-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ala-CN итд., вплоть до Ac-(Gly)11-CN,
с выходом от >95% до 43% для реакции Ac-(Gly)6-CN + (Gly)3-SH = Ac-(Gly)9-CN
Ac-(Gly)n-Xn-CN.png
Ac-(Gly)n-Xn-CN.png (89.34 KiB) Просмотров: 569

Можно ли полимеризовать дальше - не известно. Но, наверное, авторы доложили бы об успехах, если бы такие были.
Пока что имеем для полиглицина: 5+1 = 6 (13%), 6+5=11 (95%), 6+3=9 (43%).
Очевидно, что даже если бы существовал природный механизм, который бы обеспечивал трехстадийное циклическое наращивание длины олигопептидов, реакция заглохла бы к n=12-20.

Кроме того (опять же к чести авторов), приводится таблица как другие "пребиотические" соединения в концентрации 100 мМ "портят" ключевую стадию реакции:
competitor-byproduct-formula.png

competitor-byproduct.png
competitor-byproduct.png (51.14 KiB) Просмотров: 568

При pH 9 (которая выбрана в качестве стандарта) сильнее всего конкурируют: Gly-NH2 (снижает выход на 86%), фосфат (-31%), аммиак (-23%), глицин (-21%), АМФ (-16%)

Стереоизомерия.
Статья состоит из двух частей. В первой о L-/D- стероизомерах аминокислот и их производных (Ac-, -CN, -SH) не говорится ни слова, и в описании продуктов реакции пишется:
"обнаружена 54:46 (или 51:49) смесь диастереоизомеров".
Т.е., делаем вывод, что работали на D-/L-рацемате аминокислот, которые дали D-D+L-L и D-L+L-D диастереомеры дипептидов.

Вторая часть статьи посвящена "Стереосохраняющему (stereo-retentive) синтезу" из L-субстратов.
Описывается как-то криво: "All spectral data were found to be identical to those obtained for the racemic N-acetyl-L-alanine nitrile Ac-Ala-CN"
"рацемический L-продукт", что это такое?
Тем не менее, в теле статьи пишется, что, если использовать нитрилы L-аминокислот то их синтезированные производные тоже будут хиральные, L-стереоизомеры. И олигопептиды тоже хиральны.
Правда, когда они проводят "процедуры" A-F уже с L-изомерами, тогда выход реакции падает:
Синтез N-ацетил-L-аланил-нитрила из L-аланил-нитрила по "процедуре В". Выход L-продукта уже не 95%, а 42%...
Синтез N-ацетил-L-аланил-тиоамида из N-ацетил-L-аланил-нитрила по "процедуре С". Выход L-продукта уже не 95%, а 76%...
А если будет примесь D-аминокислот, то она с радостью встроится в пептиды (с образованием диастереоизомеров).

Вывод: описан новый многостадийный способ искусственного синтеза коротких пептидов. :)
Правильнее было бы написать: "Многостадийный синтез коротких пептидов из N-ацетил-С-нитрильных производных L-аминокислот с использованием гексацианоферрата, тиоацетата, гидросульфида, ацетоангидрида, метилсульфонилметана, лиофилизации и ВЭЖХ"...
Аватар пользователя
р.Б.Константин
Супермодератор
 
Сообщений: 288
Зарегистрирован: 17 апр 2008, 23:26
Кредо: Creatio+Evolutio

Re: Синтез пептидов из амино-нитрилов + H2S (Cavanelli, 2019

Сообщение Imperor » 12 июл 2019, 21:56

В общем, насколько я понял из прочитанного (и это самый главный недостаток работы) методика синтеза в данном случае точно повторяет методику синтеза "нуклеотидов Сазерленда". Мы опять видим довольно длинную цепочку из разных химических реакций, которые происходят в разных условиях и с разными реагентами. Чтобы органический синтез шел по тому пути, который хочется авторам, они эти реакции специально изолировали друг от друга.
Ну что же. Авторов можно понять. Органический синтез, он такой. Добавь пару "неправильных" веществ - и уже ничего не получается.

Второй недостаток работы (наверное, всё же не принципиальный) концентрации веществ очень высокие. Вплоть до 150 г/л для красной кровяной соли. Не могу представить себе такую ситуацию в природе, чтобы в воде плавало 150 г красной кровяной соли на 1 литр. Но возможно, если снизить концентрацию в 100 раз, то нужная химическая реакция всё равно произойдет.

Ну и третий недостаток работы (снова принципиальный) - непонятно, для чего вообще нужны эти пептиды? Ну, допустим, плавают в воде цепочки из 10 остатков глицина, связанных между собой амидной связью. И что из этого? Как это может помочь в гипотезе абиогенеза? Откуда взять сложные аминокислоты, необходимые для жизни?
Последний раз редактировалось Imperor 12 июл 2019, 22:22, всего редактировалось 1 раз.
Imperor
Форумчанин
 
Сообщений: 239
Зарегистрирован: 19 июн 2009, 12:30

Re: Синтез пептидов из амино-нитрилов + H2S (Cavanelli, 2019

Сообщение р.Б.Константин » 12 июл 2019, 22:15

Imperor писал(а) 12 июл 2019, 21:56:Ну и третий недостаток работы (снова принципиальный) - непонятно, для чего вообще нужны эти пептиды? Ну, допустим, плавают в воде цепочки из 10 остатков глицина, связанных между собой амидной связью. И что из этого? Как это может помочь в гипотезе абиогенеза?
--Это кандидат в "икону" эволюционизма. "Ведь показали же абиогенный синтез белков!"
Аватар пользователя
р.Б.Константин
Супермодератор
 
Сообщений: 288
Зарегистрирован: 17 апр 2008, 23:26
Кредо: Creatio+Evolutio

Re: Синтез пептидов из амино-нитрилов + H2S (Cavanelli, 2019

Сообщение р.Б.Константин » 12 июл 2019, 22:18

Imperor писал(а) 12 июл 2019, 21:56: Добавь пару "неправильных" веществ - и уже ничего не получается.
--К чести авторов, они даже сделали таблицу пребиотических конкурентов / ингибиторов синтеза. И пара других таблиц с результатами вариации условий. Т.е. поделилилсь "кухней неудач".
У их предшественников одни успехи.
Аватар пользователя
р.Б.Константин
Супермодератор
 
Сообщений: 288
Зарегистрирован: 17 апр 2008, 23:26
Кредо: Creatio+Evolutio

Re: Синтез пептидов из амино-нитрилов + H2S (Cavanelli, 2019

Сообщение Imperor » 12 июл 2019, 22:25

р.Б.Константин писал(а) 12 июл 2019, 22:18:
Imperor писал(а) 12 июл 2019, 21:56: Добавь пару "неправильных" веществ - и уже ничего не получается.
--К чести авторов, они даже сделали таблицу пребиотических конкурентов / ингибиторов синтеза. И пара других таблиц с результатами вариации условий. Т.е. поделилилсь "кухней неудач".
У их предшественников одни успехи.
Мне кажется, кухня неудач всё-таки резко ограничена. Почему не сказано прямым текстом:
- Если смешать все ингредиенты сразу, то вообще ничего не получается...
Имеется ли в данной статье такая искренняя и прямая фраза?
Imperor
Форумчанин
 
Сообщений: 239
Зарегистрирован: 19 июн 2009, 12:30

Re: Синтез пептидов из амино-нитрилов + H2S (Cavanelli, 2019

Сообщение р.Б.Константин » 12 июл 2019, 22:30

Imperor писал(а) 12 июл 2019, 22:25:
р.Б.Константин писал(а) 12 июл 2019, 22:18:
Imperor писал(а) 12 июл 2019, 21:56: - Если смешать все ингредиенты сразу, то вообще ничего не получается...
Имеется ли в данной статье такая искренняя и прямая фраза?
--Её нет, но этот вывод недвусмысленно вытекает из статьи :)
Кроме того, в природе многого не происходит "если всё смешать сразу". А вот если в одной луже на берегу вулкана посинтезировалось, поиспарялось, потом водичкой перенеслось в другую лужу, тоды ой!
Аватар пользователя
р.Б.Константин
Супермодератор
 
Сообщений: 288
Зарегистрирован: 17 апр 2008, 23:26
Кредо: Creatio+Evolutio

Re: Синтез пептидов из амино-нитрилов + H2S (Cavanelli, 2019

Сообщение Imperor » 13 июл 2019, 11:10

р.Б.Константин писал(а) 12 июл 2019, 22:30:--Её нет, но этот вывод недвусмысленно вытекает из статьи :)
Кроме того, в природе многого не происходит "если всё смешать сразу". А вот если в одной луже на берегу вулкана посинтезировалось, поиспарялось, потом водичкой перенеслось в другую лужу, тоды ой!
Тем не менее, высушивание в вакууме и жидкостная хроматография, так же как и присутствие только нужных реагентов и условий в каждой отдельной реакции - это очень далеко от реальной природы. За такое "моделирование природы" в любых других областях химии или биологии можно получить по шее. Моделирование природных условий было бы в том случае, если бы авторы смоделировали, собственно, процесс испарения из лужи, и дальше смотрели бы, что из этого получится. Пусть и в предположенных ими условиях. Почти наверняка в этом случае сразу вылезли бы десятки причин, из-за которых нужный органический синтез вообще бы не произошел. Хотя бы потому, что в реальной луже, помимо нужных веществ, присутствуют многие десятки других химических веществ. А какие еще дополнительные химические вещества присутствовали в той воображаемой древней луже, в которой плавали сероводород вместе с метилсульфонилметаном - это вообще не поймёшь, пока на практике не посмотришь.
Imperor
Форумчанин
 
Сообщений: 239
Зарегистрирован: 19 июн 2009, 12:30

Re: Синтез пептидов из амино-нитрилов + H2S (Cavanelli, 2019

Сообщение р.Б.Константин » 13 июл 2019, 11:31

Imperor писал(а) 13 июл 2019, 11:10:Тем не менее, высушивание в вакууме и жидкостная хроматография, так же как и присутствие только нужных реагентов и условий в каждой отдельной реакции - это очень далеко от реальной природы.
--Тем не менее, в статье есть некая изюминка: для синтеза пептидов не нужны чистые аминокислоты, нужны их альдегидные предшественники в реакции Штреккера (вместо аминокислоты NH2-C(-R)-COOH - альдегид R-CHO) в среде с NH3 и CN- - дальше, в присутствии сероводорода и Cu2+ или Fe(CN)63- - могут образовываться пептиды (многостадийно, но без жёстких условий типа кипячения в запаянной колбе три недели).

т.е.,

Σn Ri-CHO + NH3 + CN- + H2S + Cu2+ -->-->-->(pH 9, 25C) -->-->--> Ac-H2N-С(-R1)-CO-NH-...-С(-Rn)-CN

Реальные условия синтеза, конечно, неестественны, но они на порядок ближе к "пребиотическим", чем Сандерлендовские нуклеотиды...

Правда, из альдегидов даже при всех идеальных условиях, образуется небиологическая смесь диастереомеров пептидов (2n вариантов)..
И из 202=400 вариантов дипептидов реально получается лишь ~30, а для 4-5 аминокислот есть проблемы по синтезу хотя бы активированной исходной формы...
Аватар пользователя
р.Б.Константин
Супермодератор
 
Сообщений: 288
Зарегистрирован: 17 апр 2008, 23:26
Кредо: Creatio+Evolutio

Re: Синтез пептидов из амино-нитрилов + H2S (Cavanelli, 2019

Сообщение Imperor » 18 июл 2019, 10:25

р.Б.Константин писал(а) 13 июл 2019, 11:31:Тем не менее, в статье есть некая изюминка: для синтеза пептидов не нужны чистые аминокислоты, нужны их альдегидные предшественники в реакции Штреккера (вместо аминокислоты NH2-C(-R)-COOH - альдегид R-CHO) в среде с NH3 и CN- - дальше, в присутствии сероводорода и Cu2+ или Fe(CN)63- - могут образовываться пептиды (многостадийно, но без жёстких условий типа кипячения в запаянной колбе три недели).
Ну, простейшие альдегиды (формальдегид и ацетальдегид) вообще легко образуются (в восстановительных условиях), при этом химически очень активны - реагируют с очень многими веществами и дают разнообразную химию. Но это обстоятельство как раз и препятствует дальнейшим попыткам сварить "гомункулуса в грязной луже". Химические реакции бурно происходят уже между простейшими химическими реагентами, причем с разными, давая разнообразную смесь "мусорной" органики. В которой если и образуется молекула дипептида из глицина, то одна на миллион (других молекул).


Реальные условия синтеза, конечно, неестественны, но они на порядок ближе к "пребиотическим", чем Сандерлендовские нуклеотиды

Ну я не знаю :)
Например, вот это - вообще классический пример искусственного органического синтеза:
р.б.Константин писал(а):AA-CN*HCl (200 мМ), pH->9, + 100%-ный жидкий ацетоангидрид добавлялся по каплям 10 мин. из расчета 57 мл/л, 0,6М, pH постоянно доводилась до 9 щёлочью; ЛФ, ВЭЖХ
Ацетоангидрид реагирует с водой, особенно бурно в кислой среде. "Нет такого соединения как "водный раствор ацетангидрида". При гидролизе высвобождается уксусная кислота, поэтому pH постоянно титруют до pH 9.0

Я не понимаю, куда уж еще искусственней?

В общем, "изюминка" в этой работе, конечно, есть. Иначе бы эту работу просто не опубликовали. Авторы показали новую методику органического синтеза олигопептидов. Изюминка в том, что олигопептиды, оказывается, можно синтезировать и с участием альдегидных предшественников (простейших) аминокислот.
Правда, эти олигопептиды состоят почти только из остатков глицина и аланина (потому что другим альдегидам просто не откуда взяться). Какое отношение эта находка имеет к проблеме происхождения жизни, вообще непонятно.
Imperor
Форумчанин
 
Сообщений: 239
Зарегистрирован: 19 июн 2009, 12:30


Вернуться в Абиогенез

Кто сейчас на форуме

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и гости: 1

Golden Time-Золотое Время. История, религия, наука